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肝臟是藥物代謝的重要器官,，體外代謝模型多以肝臟為基礎(chǔ)。其中,，原代肝細(xì)胞作為一種肝臟體外模型,，因具有較好的體外試驗(yàn)重現(xiàn)性，基本維持了肝臟的代謝功能,，特別是較好的保留了與體內(nèi)一致的酶水平,，成為了體外藥物試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,，廣泛應(yīng)用于藥物代謝與毒理學(xué)等研究中。原代肝細(xì)胞分離常用的方法有直接剪切法,、組織塊培養(yǎng)法和兩步膠原酶灌流法等,。其中，兩步膠原酶灌流法因其對(duì)肝細(xì)胞損傷作用較小,，肝細(xì)胞產(chǎn)率和存活率高,，成為了分離原代肝細(xì)胞的經(jīng)典方法。

原代肝細(xì)胞及其應(yīng)用

原代肝細(xì)胞(Primary hepatocytes)是指從動(dòng)物肝臟直接分離的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞,，是高度分化的細(xì)胞,，具有豐富的酶系及多種特異性功能。原代肝細(xì)胞作為一種體外模型,，具有其它體外模型不可替代的優(yōu)點(diǎn)：

①與體內(nèi)環(huán)境保持一致,，酶量和輔助因子水平都是正常的生理濃度，可以在接近生理狀態(tài)的的情況下研究藥物的代謝和毒性,；

②較好保留和維持了肝細(xì)胞的完整形態(tài)和肝細(xì)胞體外代謝活性,，真實(shí)反應(yīng)了體內(nèi)的代謝情況；

③無須擔(dān)心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理問題,，亦可減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需要的的成本開支,，實(shí)現(xiàn)了減少（Reduction）、替代（Replacement）,、優(yōu)化（Refinement）的3R倫理原則,。

  原代肝細(xì)胞作為體外藥物試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，廣泛應(yīng)用于藥物代謝與毒理學(xué)等研究中：

  探討藥物在肝中的代謝途徑和藥物藥代動(dòng)力學(xué)的研究,；

  評(píng)價(jià)藥物和外源性物質(zhì)對(duì)肝臟中細(xì)胞色素P450酶誘導(dǎo)作用并探討其誘導(dǎo)機(jī)制,；

  預(yù)測(cè)和解釋藥物與藥物之間的相互作用；

  研究藥物的細(xì)胞毒性等,。

原代肝細(xì)胞分離

原代肝細(xì)胞的分離是肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)的重要基礎(chǔ)和關(guān)鍵步驟,，如何獲得高活力、數(shù)量多的肝細(xì)胞,，分離技術(shù)是關(guān)鍵的第一步,。目前，原代肝細(xì)胞的分離方法有直接剪切法,、組織塊培養(yǎng)法,、胰蛋白酶離體消化法、兩步膠原酶灌流法（Seglen灌流法）等,。

【直接剪切法】

原理：用手術(shù)剪或鋒利的刀片將肝臟切成小塊,，然后用膠原酶或胰蛋白酶進(jìn)行消化，分離得到肝細(xì)胞,。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡單,，適用于大量細(xì)胞的分離,。

缺點(diǎn)：細(xì)胞損傷較大，純度較低,。

【組織塊培養(yǎng)法】

原理：將肝臟組織切成小塊,，在培養(yǎng)皿中加入含有特定生長因子的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，使組織塊貼壁生長,，肝細(xì)胞逐漸從組織塊中游離出來,。

優(yōu)點(diǎn)：能夠保持細(xì)胞的天然狀態(tài)，適用于長期培養(yǎng),。

缺點(diǎn)：肝細(xì)胞密度不易掌控且組織塊能否游離出肝細(xì)胞無法確定,。

【胰蛋白酶消化法】

原理：用胰蛋白酶或胰酶對(duì)肝臟進(jìn)行消化，分離得到肝細(xì)胞,。

優(yōu)點(diǎn)：能夠較為徹-底地分解細(xì)胞間物質(zhì),，獲得較純的肝細(xì)胞。

缺點(diǎn)：胰蛋白酶的價(jià)格較貴,，成本較高。

【兩步膠原酶灌流法（Seglen灌流法）】

原理：用含有膠原酶的溶液通過門靜脈灌注到肝臟中,，使肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與間質(zhì)分開,，然后收集分離出的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：能夠分離出存活率高,、形態(tài)好的肝細(xì)胞,，適用于長期培養(yǎng)。

缺點(diǎn)：操作較為繁瑣,，技術(shù)要求高,，成本也相對(duì)較高。

其中,，兩步膠原酶灌流法（Seglen灌流法）是Seglen于1976年在前人的基礎(chǔ)上改良形成的,，它具有分離效果好，細(xì)胞產(chǎn)率高,，存活率高,，對(duì)細(xì)胞損傷小，細(xì)胞維持肝細(xì)胞特異性功能時(shí)間長等特點(diǎn),，是目前國際上流行的原代肝細(xì)胞分離方法,。

兩步膠原酶灌注法先使用無鈣灌注液灌注，無鈣灌注液作為預(yù)灌液,，可以將肝臟內(nèi)的殘留血液灌注出,，除去或者減少細(xì)胞間的鈣離子，以減少細(xì)胞間的粘著力,。之后再使用含膠原酶灌注液進(jìn)行灌注把組織中的細(xì)胞釋放出來,。膠原酶在消化肝組織的同時(shí)解除了細(xì)胞間接觸抑制或活化了潛在的蛋白激酶,、生長因子或受體，使肝細(xì)胞能逐漸適應(yīng)消化分離過程中所發(fā)生的細(xì)胞,、外環(huán)境及細(xì)胞的各種改變,，這些改變對(duì)離體肝細(xì)胞修復(fù)、生長及功能有重要的促進(jìn)作用,，有利于肝細(xì)胞的培養(yǎng),。

IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

兩步膠原酶灌流法現(xiàn)已成為分離原代肝細(xì)胞的經(jīng)典方法，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,，憑借先進(jìn)的設(shè)備,，專業(yè)的技術(shù)人員和多年研發(fā)的經(jīng)驗(yàn)，繼開發(fā)人,、猴,、犬、大鼠和小鼠等多種屬原代肝細(xì)胞產(chǎn)品后,，又推出基于兩步膠原酶灌流法的不同種屬的原代肝細(xì)胞分離試劑盒,。試劑盒提供了用于分離動(dòng)物原代肝細(xì)胞的主要試劑，包括灌流液,、膠原酶,、細(xì)胞洗滌液、細(xì)胞純化液等,，且試劑盒各組成成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè),，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,、重現(xiàn)性好,。

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，推出了多領(lǐng)域,、多種類的高-端科研試劑,，為藥物早期研發(fā)提供篩選工具，為生命科學(xué)領(lǐng)域的探索提供新材料,、新方法和新手段,，為食品、藥品,、化學(xué)品等的遺傳毒性研究提供便捷產(chǎn)品,，望廣大科研工作者咨詢。

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